MITA介导的细胞抗病毒反应信号转导及其调节机制 本书特色

长期以来，病毒感染与宿主免疫的机制一直是生命科学领域的研究热点。病毒入侵宿主细胞后，首先被宿主模式识别受体（pattern—recognition receptors，prrs）所识别，激活一系列的信号转导，诱导i型干扰素和白细胞介素113（interleukin 1—β，il—1β）等细胞因子的表达。这些细胞因子分泌到细胞外，与细胞表面受体结合，激活相应的信号转导，诱导大量抗病毒基因的表达，从而抑制病毒的复制，诱导被感染的细胞凋亡；同时，这些细胞因子诱导产生炎症反应，激活天然免疫细胞以及适应性免疫系统，从而杀灭病毒并清除病毒感染的细胞。因此，i型干扰素等细胞因子的表达对宿主抵抗病毒入侵起着举足轻重的作用。 　　研究表明，病毒在感染与复制的过程中产生病原相关分子模式（pathogen—associated molecular patterns，pamps），如5’三磷酸具有锅柄状结构的rna（5’ppp panhandle rna）以及双链rna（double—stranded rna，dsrna）。宿主细胞内的prr如rig—i（retinoic acid—inducible gene i）与mda5（melanoma differentiation—associated gene5）识别相应的pamp后构象发生变化，招募定位于线粒体的接头蛋白visa（virus—induced signaling adaptor）。visa通过与traf6（tumor necrosis factor receptor—associated factor 6）或traf2相互作用，激活ikk（inhibitor of kb kinase）复合物，ikk复合物磷酸化ikb（inhibitor of kb），使ikb经泛素一蛋白酶体途径降解，释放出转录因子nf—kb。同时visa与traf3以及tbkl（traf family member—as—sociated nf—kb activator—binding kinase 1）相互作用，促进tbkl磷酸化激活irf3（interferon—regulatory factor 3）。激活的转录因子如irf3与nf—kb进入细胞核结合至i型干扰素等基因的启动子上，激活i型干扰素的转录。 　　尽管*近十年的研究初步揭示了病毒感染诱导i型干扰素产生的过程，但是仍然有很多未知的问题有待进一步研究。例如，visa通过保守的traf相互作用位点与traf6和traf2相互作用激活nf—kb，而visa如何与tbkl相互作用并进一步激活irf3则并不清楚。此外，dna病毒的受体及其介导i型干扰素的机制是什么，细胞中是否存在其它未知的激活i型干扰素的蛋白等。为了寻找参与激活i型干扰素表达的蛋白，我们利用表达克隆的方法筛选了人脾脏cdna表达文库，发现一个功能未知的蛋白能有效激活irf3，我们将其命名为mita（mediator of irf3 activator）。研究表明，mita能有效激活转录因子irf3而不激活nf—kb。rnai下调mita的表达则抑制病毒诱导的irf3和nf—kb的激活、ifn—β等抗病毒基因的表达以及细胞抗病毒反应。mita的n端含有四个跨膜结构域，其中第三个跨膜结构域（aalll—150）对其线粒体定位、与visa相互作用以及自身的多聚化非常重要，第二个跨膜结构与第三个跨膜结构之间的部分（aa81—110）对促进tbk1—irf3相互作用是必需的。内源性免疫沉淀实验表明，mita持续性地与v[sa和irf3相互作用，病毒感染后，mita将tbk1招募至线粒体，介导visa—tbkl相互作用；同时，mita通过自身多聚化形成visa—mita—bk1—irf3复合物。在这一复合物中，mita第358位的丝氨酸被tbkl磷酸化，这一过程为irf3的磷酸化激活非常重要。

MITA介导的细胞抗病毒反应信号转导及其调节机制 目录

**章 研究背景
**节 抗病毒天然免疫概述
一、天然免疫简介
二、抗病毒天然免疫反应信号转导概述
三、i型干扰素转录激活机制
第二节 prrs及其介导的天然抗病毒免疫反应信号转导
一、识别病毒的模式识别受体及其对病毒的识别
二、prrs协同作用介导细胞抗病毒反应
三、prrs介导的细胞抗病毒反应信号转导
第三节 prrs介导的信号转导的调节机制
一、阻断介导信号转导的分子间的相互作用
二、降解介导信号转导的蛋白
三、调节信号分子的去泛素化
四、其他
第二章 实验材料与实验方法
**节 实验材料
一、荧光素酶报告基因实验相关材料
二、细胞、细胞因子与细胞培养
三、载体构建所需材料
四、酵母双杂交所需材料
五、免疫共沉淀以及western blot实验相关材料
第二节 实验方法
一、质粒构建、dna纯化、磷酸钙沉淀转梁293细胞、免疫共沉淀、westem blot与rna blot
二、荧光素酶报告基因实验
三、表达克隆筛选
四、酵母双杂交实验
五、亚细胞器分离实验
六、rt-pcr实验
七、vsv空斑实验
八、泛素化实验
九、lc-ms／ms鉴定mita磷酸化位点
十、免疫荧光与激光共聚焦显微镜观察
十一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二、原代细胞的培养与转染
十三、32p in vivo标记细胞与放射自显影实验
十四、体外泛素化实验
第三章 实验结果与讨论
**节 mita介导的信号转导机制
一、研究背景与立项依据概述
二、mita的鉴定与表达分析

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